生物體內(nèi)存在著大量的級聯(lián)反應(yīng)（如光合過程、代謝過程等），多種生物酶通過協(xié)同效應(yīng)保證這些復(fù)雜反應(yīng)高度有序地完成。為了模擬這樣的生物學(xué)過程，科學(xué)家們嘗試在體外人工制備多酶反應(yīng)體系，利用酶各自的催化特性創(chuàng)造出復(fù)雜的多酶復(fù)合體 (Multi-enzyme complexes，MECs)，通過提高中間產(chǎn)物在不同酶間的運轉(zhuǎn)濃度，更高效地完成整個催化過程。同時，多酶體系也適用于原位輔酶再生過程，使規(guī)?；锎呋某杀镜玫接行Ы档?。
圖1. 多酶催化體系示意
近年來，多酶反應(yīng)體系中的共固定化技術(shù)越來越受到關(guān)注。該技術(shù)是將多種酶固定在同一載體上形成共固定化系統(tǒng)，或通過交聯(lián)形成共交聯(lián)酶簇；相較于多酶共反應(yīng)的方式（多種游離酶置于同一反應(yīng)器中，進而得到目標產(chǎn)物），具有更高的酶穩(wěn)定性、重復(fù)利用率和產(chǎn)品收率。共固定化方法通常建立在單酶固定技術(shù)的基礎(chǔ)上，主要方法包括包埋、物理吸附、共價結(jié)合、親和吸附、DNA 定向自組裝固定和交聯(lián)酶聚集等，或?qū)⒍喾N方法結(jié)合來制定策略。
多酶共固定化體系的建立非常具有挑戰(zhàn)性——不僅需要篩選合適的固定化方法，分析相關(guān)的反應(yīng)動力學(xué)和傳質(zhì)特征以確定最佳反應(yīng)條件，盡可能保持體系中所有酶的活性和穩(wěn)定性，還要優(yōu)化平衡各催化組分使它們達到協(xié)同作用，最終設(shè)計出理想的固定化策略。
凱萊英醫(yī)藥集團（股票代碼：002821.SZ，以下簡稱“凱萊英”）技術(shù)團隊在多酶共固定化技術(shù)的研究中，不僅成功實現(xiàn)包括轉(zhuǎn)氨酶在內(nèi)的多種酶的共固定化，并且嘗試將其與連續(xù)反應(yīng)技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于藥物研發(fā)與生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，使整個生物催化過程更高效、更環(huán)保、更可控。
多酶共固定化連續(xù)反應(yīng)體系中，在底物濃度可控、產(chǎn)物不斷移除、無機械攪拌、壓力和溫度嚴格監(jiān)督的環(huán)境下，酶受到的影響非常有限，顯著增長了使用壽命，也更容易進行下游處理。尤其當(dāng)許多催化過程在非均相條件下進行時，連續(xù)反應(yīng)器卓越的混合效率可以轉(zhuǎn)化為對傳質(zhì)的改善，從而加速整個過程，反應(yīng)時間從幾小時大幅縮減到幾分鐘，空時產(chǎn)率（STY）可獲得高達650倍的提升，可輕松實現(xiàn)集成處理和分析控制。同時，連續(xù)反應(yīng)還能通過精準的過程控制提升反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，有效減低三廢生成量。
凱萊英技術(shù)團隊的科學(xué)家們嘗試在轉(zhuǎn)氨基作用常規(guī)方法的基礎(chǔ)上建立多酶共固定化連續(xù)反應(yīng)體系，以解決該類反應(yīng)中產(chǎn)率和經(jīng)濟性相關(guān)的多個難題。轉(zhuǎn)氨基作用是合成某些氨基酸的一條重要途徑，包括以丙氨酸作為氨基供體，底物酮酸通過氨基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為氨基酸。由于丙氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物丙酮酸會對轉(zhuǎn)氨酶活性產(chǎn)生抑制作用，使得常規(guī)方法的轉(zhuǎn)化率僅有60％-70％。為了減輕這種抑制，研究人員使用LDH（乳酸脫氫酶）將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，并將FDH/GDH用于NADH（還原型輔酶Ⅰ）的再生。
圖2. 多酶反應(yīng)體系示例
凱萊英技術(shù)團隊嘗試將反應(yīng)中的三種酶分別用幾種不同方法進行共固定，并應(yīng)用于兩種連續(xù)流式反應(yīng)器中，包括連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器（CSTR）和填充床反應(yīng)器（PBR）。通過對固定化方法、載體、反應(yīng)條件、反應(yīng)器類型等多方面因素的篩選和平衡，研究人員優(yōu)選出最佳策略，成功建立了該反應(yīng)的多酶共固定化連續(xù)反應(yīng)體系，底物的轉(zhuǎn)化率得到大幅提升（>99%），可實現(xiàn)連續(xù)轉(zhuǎn)化200h以上。
多酶共固定化連續(xù)反應(yīng)體系的研究過程并非兩種技術(shù)的簡單疊加，其結(jié)果卻是令人驚喜的“1+1>2”。隨著酶工程技術(shù)的進步，多酶共固定化技術(shù)將愈加成熟。相信人工制備的固定化多酶將更接近于天然的多酶復(fù)合體，并具有更強的催化效率。凱萊英致力于綠色化學(xué)制藥技術(shù)的開發(fā)與商業(yè)化應(yīng)用，多酶共固定化和連續(xù)反應(yīng)的有機結(jié)合將有望引領(lǐng)行業(yè)革新，以更綠色、更安全、更可靠的技術(shù)惠及全球醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)與臨床患者。
